Fő különbség - NGS vs Sanger szekvenálás
A következő generációs szekvenálás (NGS) és a Sanger szekvenálás kétféle nukleotid szekvenálási technika, amelyet az idő során fejlesztettek ki. A Sanger Sequencing módszert sok éven át széles körben alkalmazták, és az NGS előnyei miatt nemrégiben felváltotta. A legfontosabb különbség az NGS és a Sanger szekvenálás között az, hogy az NGS a szekvenciák millióinak egyidejű, gyors szekvenálásának elvén működik egy szekvenálórendszeren keresztül, míg a Sanger szekvenálás a láncvégződés elvén dolgozik, a dideoxinukleotidok DNS polimeráz enzim általi szelektív beépítése miatt. a DNS-replikáció és az ennek eredményeként keletkező fragmensek kapilláris elektroforézissel történő elválasztása során.
TARTALOM
1. Áttekintés és a legfontosabb különbség
2. Mi a nukleotid szekvenálás
3. Mi az NGS
4. Mi a Sanger szekvenálás
5. Egymás melletti összehasonlítás - NGS vs Sanger szekvenálás
6. Összefoglalás
Mi a nukleotid szekvenálás?
A genetikai információkat egy szervezet DNS vagy RNS nukleotidszekvenciája tárolja. A nukleotidok helyes sorrendjének meghatározási folyamata (négy bázis felhasználásával) egy adott fragmensben (egy génben, géncsoportban, kromoszómában és a teljes genomban) nukleotidszekvenálásként ismert. Nagyon fontos a genomvizsgálatokban, az igazságügyi vizsgálatokban, a virológiában, a biológiai szisztematikában, az orvosi diagnózisban, a biotechnológiában és számos más területen a gének szerkezetének és működésének elemzése. Különböző típusú szekvenálási módszerek vannak, amelyeket a tudósok fejlesztettek ki. Közülük a Frederick Sanger által 1977-ben kifejlesztett Sanger-szekvenálást széles körben használták és népszerűsítették hosszú ideig, amíg a Next Generation Sequencing felváltotta.
Mi az NGS?
A Next Generation Sequencing (NGS) kifejezés a modern, nagy teljesítményű szekvenálási folyamatokra utal. Számos modern szekvenálási technológiát ír le, amelyek forradalmasították a genomikai vizsgálatokat és a molekuláris biológiát. Ezek a technikák az Illumina, a Roche 454, az Ion Proton és a SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) szekvenálás. Az NGS rendszerek gyorsabbak és olcsóbbak. Négy fő DNS-szekvenálási módszert alkalmaznak az NGS rendszerekben, nevezetesen; piroszekvenálás, szekvenálás szintézissel, szekvenálás ligálással és ion félvezető szekvenálás. Nagyszámú DNS vagy RNS szál (millió) szekvenálható párhuzamosan. Ez lehetővé teszi a szervezetek teljes genomjának szekvenálását rövid időn belül, ellentétben a Sanger szekvenálással, amely több időt vesz igénybe.
Az NGS-nek számos előnye van a hagyományos szekvenáló Sanger módszerrel szemben. Nagy sebességű, pontosabb és költséghatékonyabb eljárás, amely kis mintamérettel elvégezhető. Az NGS alkalmazható metagenomikai vizsgálatokban, az egyes genomokban az inszerciók és deléciók stb. Miatti variációk detektálásában és a génexpressziók elemzésében.
Ábra: Fejlesztések az NGS szekvenciájában
Mi a Sanger szekvenálás?
A Sanger szekvenálás Frederick Sanger és munkatársai által 1977-ben kifejlesztett szekvenálási módszer egy adott DNS-fragmens pontos nukleotid-sorrendjének meghatározására. Láncterminációs szekvenciának vagy Dideoxi szekvenálásnak is nevezik. Ennek a módszernek a működési elve a szálszintézis befejezése egy láncvégződő dideoxinukleotidok (ddNTP-k), például ddGTP, ddCTP, ddATP és ddTTP szelektív beépítésével a DNS polimeráz által a DNS replikációja során. A normál nukleotidok 3 'OH csoportokkal rendelkeznek a szomszédos nukleotidok közötti foszfodiészter kötés kialakulásához a szálképződés folytatásához. A ddNTP-kből azonban hiányzik ez a 3 'OH csoport, és nem képesek foszfodiészter kötéseket kialakítani a nukleotidok között. Ezért a lánc megnyúlása megszűnik.
Ebben a módszerben a szekvenálandó egyszálú DNS templátszálként szolgál az in vitro DNS-szintézishez. További követelmények az oligonukleotid primer, a dezoxinukleotid prekurzorok és a DNS polimeráz enzim. Amikor a célfragmens határoló végei ismertek, a primerek könnyen megtervezhetők a DNS-replikációhoz. Négy különálló DNS-szintézisreakciót hajtanak végre négy különálló csőben. Minden cső külön ddNTP-vel rendelkezik, más követelményekkel együtt. Az adott nukleotidból dNTP-k és ddNTP-k keverékét adjuk hozzá. Hasonlóképpen négy külön reakciót hajtunk végre négy csőben, négy keverékkel. A reakciók után elvégezzük a DNS-fragmensek detektálását és a fragmens-minta szekvencia-információvá alakítását. A keletkező DNS-fragmenseket hővel denaturáljuk és gélelektroforézissel választjuk el. Radioaktív nukleotidok alkalmazása esetén a poliakrilamid-gél sávképződése autoradiográfiával látható. Ha ez a módszer fluoreszcensen jelölt dideoxinukleotidokat használ, akkor az leolvasható gélen keresztül csökkenthető, és áthaladhat egy lézersugárral, amelyet a fluoreszcens detektor detektálhat. Annak elkerülése érdekében, hogy felmerülhessenek olyan hibák, amelyek akkor fordulhatnak elő, amikor egy szekvenciát a szem olvas és manuálisan bevisz a számítógépbe, ez a módszer az automatizált szekvenszer használatával alakult ki a számítógéppel együtt. Annak elkerülése érdekében, hogy felmerülhessenek olyan hibák, amelyek akkor fordulhatnak elő, amikor egy szekvenciát a szem olvas és manuálisan bevisz a számítógépbe, ez a módszer az automatizált szekvenszer használatával alakult ki a számítógéppel együtt. Annak elkerülése érdekében, hogy a szekvencia szemmel történő olvasása és a számítógépbe történő manuális bevitel során felmerülő hibák elkerülhetők legyenek, ez a módszer az automatizált szekvenszer használatával fejlett ki a számítógéppel együtt.
Ezt a módszert alkalmazzák a DNS szekvenciázására az Emberi Genom projektből. Ezt a módszert továbbra is fejlett módosításokkal használják, mivel pontos sorrendinformációt ad annak ellenére, hogy drága és lassú folyamat.
_2 ábra: Sanger szekvenálás
Mi a különbség az NGS és a Sanger Sequencing között?
Különböző cikk a táblázat előtt
NGS vs Sanger szekvenálás |
|
| A Next Generation Sequencing (NGS) modern, nagy teljesítményű szekvenálási folyamatokra utal. Számos különféle modern szekvenálási technológiát ír le | A Sanger-szekvenálás Frederick Sanger által kifejlesztett szekvenálási módszer egy adott DNS-fragmens pontos nukleotid-sorrendjének meghatározására. |
| Költséghatékonyság | |
| Az NGS olcsóbb eljárás, mert csökkenti az időt, az ember erejét és a vegyszereket. | Ez költséges folyamat, mert időbe telik, az ember ereje és még több vegyszer szükséges. |
| Sebesség | |
| Ez gyorsabb, mivel sok szál kémiai detektálása és a jel detektálása párhuzamosan zajlik. | Ez időigényes, mivel a kémiai detektálás és a jel detektálása két külön folyamatként történik, és csak a szálak képesek egyszerre olvasni. |
| Megbízhatóság | |
| Az NGS megbízható. | A Sanger szekvenálás kevésbé megbízható |
| Minta nagysága | |
| Az NGS-nek kevesebb mennyiségű DNS szükséges. | Ehhez a módszerhez nagy mennyiségű templát DNS szükséges. |
| DNS-bázisok szekvenált töredékenként | |
| A szekvenált fragmensre jutó DNS-bázisok száma alacsonyabb, mint a Sanger-módszer | A generáló szekvenciák hosszabbak, mint az NGS szekvenciák. |
Összegzés - NGS vs Sanger szekvenálás
Az NGS és a Sanger-szekvenálás a molekuláris biológiában széles körben alkalmazott nukleotid-szekvenálási technika. A Sanger szekvenálás egy korai szekvenálási módszer, amelyet NGS váltott fel. A fő különbség az NGS és a Sanger szekvenálás között az, hogy az NGS nagy sebességű, pontosabb és költséghatékonyabb folyamat, mint a Sanger szekvenálás. Mindkét technika jelentős járványokat okozott a genetikában és a biotechnológiában.
