Fő különbség - Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing
A DNS-szekvenálás nagyon fontos a DNS-elemzés szempontjából, mivel egy adott DNS-régióban a helyes nukleotid-elrendezés ismerete sok fontos információt tár fel róla. Különböző DNS-szekvenálási módszerek léteznek. A Sanger-szekvenálás és a Pyrosequencing két különböző DNS-szekvenálási módszer, amelyet széles körben használnak a molekuláris biológiában. A legfontosabb különbség a Sanger-szekvenálás és a Pyrosequencing között az, hogy a Sanger-szekvenálás dideoxinukleotidokat használ a DNS szintézisének leállítására a nukleotid-szekvencia leolvasására, míg a pirosequencing a nukleotidok beépítésével és a komplementer szekvencia szintetizálásával detektálja a pirofoszfát felszabadulást a szekvencia pontos sorrendjének beolvasása érdekében.
TARTALOM
1. Áttekintés és a legfontosabb különbség
2. Mi a Sanger szekvenálás
3. Mi a Pyrosequencing
4. Egymás melletti összehasonlítás - Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing
5. Összegzés
Mi a Sanger szekvenálás?
A Sanger szekvenálás egy első generációs DNS-szekvenálási módszer, amelyet Frederick Sanger és főiskolái fejlesztettek ki 1977-ben. Láncterminálási szekvencia vagy Dideoxi szekvenálás néven is ismert, mivel a dideoxinukleotidok (ddNTP) által történő lánczáráson alapul. Ezt a módszert több mint 30 éven át széles körben alkalmazták az új generációs szekvenálás (NGS) kidolgozásáig. A Sanger-szekvenálási technika lehetővé tette a helyes nukleotid-sorrend felfedezését vagy egy adott DNS-fragmens rögzítését. Ez a ddNTP-k szelektív beépítésén és a DNS-szintézis befejezésén alapul az in vitro DNS-replikáció során. A 3 'OH csoportok hiánya a foszfodiészter kötés kialakulásának folytatásához a szomszédos nukleotidok között a ddNTP-k egyedülálló tulajdonsága. Ezért, amint a ddNTP kapcsolódik, a lánc megnyúlása megszűnik és abból a pontból véget ér. Négy ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP és ddTTP - használatos a Sanger szekvenálásban. Ezek a nukleotidok megállítják a DNS-replikációs folyamatot, amikor beépülnek a növekvő DNS-szálba, és változó hosszúságú rövid DNS-t eredményeznek. Kapilláris gélelektroforézist alkalmaznak ezeknek a rövid DNS-szálaknak a gélen való méretük szerinti rendezésére, a 01. ábra szerint.
1. ábra: Szintetizált rövid DNS kapilláris gél elektroforézise
A DNS in vitro replikációjához kevés követelményt kell előírni. Ezek DNS-polimeráz enzim, templát DNS, oligonukleotid primerek és dezoxinukleotidok (dNTP). A Sanger-szekvenálás során a DNS-replikációt négy különálló kémcsőben hajtják végre, külön-külön négyféle ddNTP-vel. A dezoxinukleotidokat nem helyettesítik teljesen a megfelelő ddNTP-k. A csőbe az adott dNTP keverékét (például; dATP + ddATP) visszük be. Négy különálló csőterméket gélen futtatunk négy külön üregben. Ezután a gél leolvasásával a szekvencia elkészíthető a 02. ábra szerint.
02. ábra: Sanger szekvenálás
A Sanger szekvenálás fontos technika, amely a molekuláris biológia számos területén segít. Az emberi genom projekt Sanger szekvenáláson alapuló módszerekkel sikeresen lezárult. A Sanger szekvenálás hasznos a cél DNS szekvenálásában, a rák és a genetikai betegségek kutatásában, a génexpresszió elemzésében, az emberi azonosításban, a kórokozók detektálásában, a mikrobiális szekvenálásban stb.
A Sanger szekvenálásnak számos hátránya van:
- A szekvenálandó DNS hossza nem lehet hosszabb 1000 bázispárnál
- Egyszerre csak egy szál szekvenálható.
- A folyamat időigényes és költséges.
Ezért idővel új fejlett szekvenálási technikákat fejlesztettek ki e problémák leküzdésére. A Sanger szekvenálás azonban továbbra is használatban van, nagyon pontos eredményei miatt, körülbelül 850 bázispár hosszúságú fragmensig.
Mi a piroszekvenálás?
A piroszekvenálás egy új DNS-szekvenálási technika, amely a „szintetikus szekvenáláson” alapul. Ez a technika a pirofoszfát felszabadulás kimutatására támaszkodik a nukleotid beépülése után. Az eljárást négy különböző enzim alkalmazza: DNS polimer, ATP szulfuriláz, luciferáz és apiráz, valamint két szubsztrát adenozin-5'-foszfoszulfát (APS) és luciferin.
A folyamat azzal kezdődik, hogy a primer megkötődik az egyszálú DNS-templáttal, és a DNS-polimeráz megkezdi a vele komplementer nukleotidok beépülését. Amikor a nukleotidok összekapcsolódnak (nukleinsavpolimerizáció), pirofoszfát (két foszfátcsoport kapcsolódik egymáshoz) csoportok és energia szabadul fel. Minden egyes nukleotid addíció ekvimoláris mennyiségű pirofoszfátot szabadít fel. A pirofoszfát ATP-szulfurilázzal átalakul ATP -vé APS szubsztrát jelenlétében. A keletkezett ATP a luciferin által okozott luciferin által oxiluciferinné történő átalakulást hajtja végre, látható fényt termelve az ATP-k mennyiségével arányos mennyiségben. A fényt egy foton detektáló eszköz vagy a fotomultiplikátor segítségével érzékeli, és pirogramot hoz létre. Az apiráz lebontja az ATP-t és a beépítetlen dNTP-ket a reakcióelegyben. A dNTP hozzáadása egyszerre történik. Mivel a nukleotid hozzáadása a fény beépülése és detektálása alapján ismert, a templát szekvenciája meghatározható. A pirogramot használjuk a minta DNS nukleotidszekvenciájának előállítására, a 03. ábra szerint.
A piroszekvenálás nagyon fontos az egy nukleotid polimorfizmus elemzésében és a DNS rövid szakaszainak szekvenálásában. A nagy pontosság, rugalmasság, az automatizálás és a párhuzamos feldolgozás előnyei a piroszekvenálás előnyei a Sanger szekvenálási technikákkal szemben.
03. ábra: Piroszekvenálás
Mi a különbség a Sanger szekvenálás és a Pyrosequencing között?
Különböző cikk a táblázat előtt
Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing |
|
| A Sanger szekvenálás egy DNS szekvenálási módszer, amely a ddNTP-k szelektív beépítésén alapul DNS polimeráz és lánc termináció útján. | A piroszekvenálás egy DNS-szekvenálási módszer, amely a pirofoszfát felszabadulás detektálásán alapul nukleotid beépülése után. |
| A ddNTP használata | |
| ddNTP-ket használnak a DNS-replikáció befejezésére | A ddNTP-ket nem használják. |
| Enzimek érintettek | |
| DNS-polimerázt használunk. | Négy enzimet alkalmaznak: DNS-polimerázt, ATP-szulfurilázt, Luciferázt és Apirázt. |
| Használt hordozók | |
| Az APS-t és a Luciferint nem alkalmazzák. | Adenozin-5'-foszfoszulfátot (APS) és luciferint alkalmazunk. |
| Maximális hőmérséklet | |
| Ez egy lassú folyamat. | Ez egy gyors folyamat. |
Összegzés - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
A Sanger szekvenálás és a Pyrosequencing a DNS-szekvenálás két módszere, amelyet a molekuláris biológiában alkalmaznak. A Sanger szekvenálás a nukleotidok egymás utáni sorrendjét állítja össze a lánc megnyúlásának megszüntetésével, míg a piroszekvenálás a nukleotidok pontos sorrendjét egymás után, nukleotidok beépítésével és a pirofoszfátok felszabadulásának detektálásával. Ezért a fő különbség a Sanger-szekvenálás és a Pyrosequencing között az, hogy a Sanger-szekvenálás a lánc-terminációval történő szekvenáláson, míg a pirose-szekvenálás a szintézis-szekvenáláson működik.
