Fő különbség - PCR és DNS szekvenálás
A PCR és a DNS szekvenálás a molekuláris biológia két fontos technikája. A polimeráz láncreakció (PCR) az a folyamat, amely nagyszámú példányt hoz létre egy DNS-fragmensből. A DNS-szekvenálás az a technika, amely egy adott DNS-fragmens nukleotidjainak pontos sorrendjét eredményezi. Ez a legfontosabb különbség a PCR és a DNS szekvenálás között. A PCR a DNS-szekvenálás egyik fő lépése.
TARTALOM
1. Áttekintés és a legfontosabb különbség
2. Mi a PCR
3. Mi a DNS szekvenálás
4. Egymás melletti összehasonlítás - PCR vs DNS szekvencia
5. Összefoglalás
Mi a PCR?
A polimeráz láncreakció (PCR) a molekuláris biológiában alkalmazott DNS-amplifikációs technika. Egy adott DNS-fragmens ezer-millió példányát állítja elő. Ezt a módszert Kary Mullis fejlesztette ki 1983-ban. Ebben a technikában az amplifikálandó DNS-fragmens szolgál templátként, és a DNS-polimeráz enzim komplementer nukleotidokat ad hozzá a PCR-keverékben elérhető primerhez. A PCR reakció végén a minta DNS sok másolatát szintetizálják.
A PCR-keveréknek különböző komponensei vannak, beleértve a DNS-t, a DNS-polimerázt (Taq-polimeráz), a primereket (előre és hátra indító primerek), nukleotidokat (a DNS építőkövei) és egy puffert. A PCR egy PCR-gépen belül történik, és a megfelelő PCR-keveréket be kell tölteni a gépbe, és a megfelelő programot kell hajtani. Ez a technika lehetővé teszi a DNS egy adott szakaszának ezer-millió példányának előállítását nagyon kis mennyiségű DNS-ből.
A PCR-reakciók ciklikus módon fordulnak elő, hogy a gélen látható mennyiségű PCR-terméket állítsanak elő. A PCR-reakciónak három fő lépése van, nevezetesen a denaturálás, a primer hőkezelése és a szál meghosszabbítása, amint azt a 01. ábra mutatja. Ez a három lépés három különböző hőmérsékleten történik. A DNS kettős szálú formában hidrogénkötésekkel létezik a komplementer bázisok között. A implikáció előtt a kettős szálú DNS-t el kell választani egymástól. Magas hőmérséklet megadásával történik. Magas hőmérsékleten a kettős szálú DNS denaturálódik egyetlen szálra. Ezután a primereknek közelebb kell kerülniük a specifikus fragmens vagy a DNS-gén határoló végeihez. Az alapozó egyszálú DNS rövid darabja, amely komplementer a célszekvenciával. Az előremenő és a reverz primerek a lágyítási hőmérsékleten a denaturált minta DNS szélső végén lévő komplementer bázisokkal izzadnak. Az alapozóknak hőállónak kell lenniük. Miután a primerek megsemmisítik a minta DNS-t, a taq-polimeráz enzim a cél DNS-sel komplementer nukleotidok hozzáadásával megkezdi az új szálak szintézisét. A Taq-polimeráz egy hőstabil enzim, amelyet a Thermus aquaticus nevű termofil baktériumból izoláltak. A PCR puffer fenntartja az optimális feltételeket a taq polimeráz működéséhez. A PCR-reakciók ezen három szakaszát megismételjük a kívánt mennyiségű PCR-termék előállításához. Minden egyes PCR-reakció után a DNS-kópia száma megduplázódik. Ezért a PCR-ben exponenciális amplifikáció figyelhető meg. A PCR-termékek megfigyelhetők gélelektroforézissel, és további vizsgálatok céljából megtisztíthatók.
01. ábra: A PCR reakció főbb lépései
A PCR értékes eszköz az orvosi és biológiai kutatásokban. A PCR-nek különleges értéke van az igazságügyi orvostudományban, mivel a bűnözők apró mintáiból fel tudja erősíteni a DNS-t a vizsgálatokhoz, és törvényszéki DNS-profilokat készíthet. A PCR-t széles körben alkalmazzák a molekuláris biológia számos területén, ideértve a genotipizálást, a gének klónozását, a mutációk detektálását, a DNS-szekvenálást, a DNS-mikrosávokat és az apasági teszteket stb.
02. ábra: Polimeráz láncreakció
Mi a DNS-szekvenálás?
A DNS-szekvenálás a nukleotidok - adenin, guanin, citozin és timin - pontos sorrendjének meghatározása egy adott DNS-fragmensben. A genetikai információkat a DNS-szekvenciák a nukleotidok helyes sorrendjében tárolják. Ennélfogva a nukleotidok pontos sorrendjének megtalálása egy DNS-fragmensben nagyon fontos a gének szerkezetének és működésének ismeretéhez.
A DNS-szekvenálási protokoll különböző folyamatokat foglal magában. Az első lépés az érdekelt DNS vagy egy szervezet genomiális DNS-jének izolálása. PCR alkalmazásával (a fent leírtak szerint) a DNS kívánt régióját amplifikálni kell. Az amplifikált PCR-terméket gélelektroforézissel el kell választani és meg kell tisztítani. Az amplifikált fragmenseket sablonokként szolgáljuk a szekvenáláshoz. A szekvenálás történhet Sanger szekvenálás vagy nagy áteresztőképességű szekvenálás módszerével. A Sanger-szekvencia megköveteli a kapott DNS-fragmensek kapilláris elektroforézisét. A helyes nukleotid-sorrend meghatározása történhet autoradiografok kézi leolvasásával vagy automatizált DNS-szekvenátorokkal.
A génszekvenálás hozzájárult az emberi genom projekthez, és megkönnyítette az emberi genom feltérképezését 2003-ban. Az igazságügyi orvostudományban a DNS-szekvenálás lehetővé tette az egyedi DNS-szekvenciákat mutató és a bűnözők azonosítását lehetővé tevő egyedek azonosítását. Az orvostudományban a DNS-szekvenálás felhasználható a genetikai és egyéb betegségekért felelős gének felderítésére, a hibás gének felkutatására és helyes génekkel való helyettesítésére. A mezőgazdaságban néhány mikroorganizmus DNS-szekvenálási információját felhasználják gazdaságilag kívánt tulajdonságokkal rendelkező transzgénikus növények előállításához.
03. ábra: DNS-szekvenálás
Mi a különbség a PCR és a DNS szekvenálás között?
Különböző cikk a táblázat előtt
PCR vs DNS szekvenálás |
|
| A PCR-folyamat ezer vagy millió példányban hozza létre az érdekelt DNS-fragmenst. | A DNS-szekvenálás az a folyamat, amely meghatározza az adott DNS-fragmens nukleotidjainak pontos sorrendjét. |
| Eredmény | |
| A PCR ezer-millió példányt hoz létre egy adott DNS-fragmensből | Ez egy adott DNS-fragmens bázisainak helyes sorrendjét eredményezi. |
| A ddNTP-k bevonása | |
| A PCR nem igényel ddNTP-ket. DNTP-ket használ. | A DNS-szekvenáláshoz ddNTP-k szükségesek a szálképződés befejezéséhez. |
Összegzés - PCR és DNS szekvenálás
A PCR és a DNS-szekvenálás nagyon fontos eszköz a molekuláris biológia számos területén. A DNS-fragmensek amplifikációját PCR-technikával végezzük, míg a DNS-fragmens nukleotidjainak helyes sorrendjét a DNS-szekvenálás határozza meg. Ez a különbség a PCR és a DNS szekvenálás között.
