Fő különbség - PCR-alapozók és szekvenciális alapozók
A molekuláris biológia területén a közelmúltban elért fejleményekkel különféle genetikai technikákat fejlesztettek ki, amelyek megkönnyítették és pontosak voltak az alany különböző területeinek vizsgálati folyamatai. A PCR és más szekvenálási eljárások két fontos ilyen technika. Különböző alkomponenseket használnak. A primereket a PCR és a szekvenálási technikák közös fő alkomponensének tekintik. A PCR-láncindítókat egy adott DNS-szekvencia amplifikálására használják, míg a szekvenáló láncindítókat egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben, azzal a céllal, hogy felfedjék a nukleotid-szekvencia sajátos sorrendjét. Ez a legfontosabb különbség a PCR-primerek és a szekvenáló primerek között.
TARTALOM
1. Áttekintés és kulcsfontosságú különbségek
2. Mik a PCR alapozók
3. Mik a szekvenáló alapozók
4. A PCR alapozók és a szekvenáló alapozók közötti hasonlóság
5. Egymás melletti összehasonlítás - PCR alapozók és a szekvenáló alapozók táblázatos formában
6. Összefoglalás
Mik azok a PCR primerek?
A polimeráz láncreakció (PCR) egy genetikai technika, amelyet a molekuláris biológia területén alkalmaznak annak érdekében, hogy egy adott DNS-szegmens egyetlen vagy néhány példányát amplifikálják, és sok millió azonos kópiát nyerjenek. A PCR-reakció során különböző komponenseket alkalmaznak, beleértve a primereket is. A primerek rövid, 18-25 nukleotid hosszúságú DNS-szálak, amelyek kompatibilisek az amplifikálni kívánt DNS-fragmensek kezdő és végrégiójával. Az alapozók lehetnek előremenő és fordított alapozók. Ezek a primerek kötődnek a DNS-fragmenshez azokon a pontokon, ahol a DNS-polimerázt arra készteti, hogy a specifikus primerhez kötődjön a helyszínen, és elindítsa az új DNS-szál szintézisét.
A primerek kiválasztása fontos szempont a PCR folyamatban. Fontos az alapozó hosszának megválasztása. Az ideális hosszúság 18-25 nukleotid lenne. Ha a hosszúság túl rövid vagy túl hosszú, akkor a primerek nem kötődnek a pontosan amplifikálni kívánt DNS-szekvenciához. A túl rövid hosszúságú láncindítók nem specifikus láncindítókhoz vezetnek a DNS-szekvencia különböző helyein.
01. ábra: PCR primerek
A jó primer guanin- és citozin (GC) tartalmának a 40-60 tartományban kell lennie. Az alapozó hőkezelési hőmérséklete és az olvadás hőmérséklete létfontosságú tényezők a PCR során. Az olvadás hőmérsékletét pontosan kell kiszámítani, és az alapozó hőkezelési hőmérsékletének 5 0 C-kal alacsonyabbnak kell lennie az olvadás hőmérsékleténél. Az olvadási hőmérséklet legyen 60 ° C és 75 ° C. Túl magas vagy túl alacsony hőmérséklet kevésbé aktív DNS-polimeráz aktivitást eredményez.
Mik azok a szekvenáló alapozók?
A szekvenáló primereket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben alkalmazzuk azzal a céllal, hogy felfedjük annak specifikus azonosságát. A jó szekvenálási eredmények elérése érdekében fontos a kiváló minőségű primerek és sablonok. Tehát, ha a primereket kiválasztjuk, azoknak egyedinek kell lenniük egy adott régióban, ahol szekvenciázni szeretnénk. Megfelelő orientációval kell rendelkeznie, ahol a szekvenciákat általában a primerek 3 '- 5' végétől generálják. A szekvenciának hiányoznia kell a nemkívánatos önhibridizációtól, például a hajtűhurkok kialakulásától. Nem tartalmazhatja a guanin bázisok egymást követő képződését.
A primer olvadási hőmérsékletének (Tm) alkalmasnak kell lennie a szekvenálás körülményeire. Ezért 52 ° C és 74 ° C között kell lennie. A primerként használt oligonukleotidok előkészítését meg kell tisztítani, hogy a kívánt teljes hosszúságú szekvenciát elérjük. Ha az oligonukleotidok szennyeződéseket tartalmaznak, a primer szekvencia jelátvitel különböző primer helyekről kerül egymásra, és ez csökkenti a bázis sejtek számát is.
02. ábra: Szekvenáló alapozók
Az oligonukleotid primer olvadási hőmérséklete (Tm) meghatározza, hogy a komplementer DNS-szálak milyen erősen hibridizálódnak egymással. A Tm termodinamikai számításnak tekinthető, ahol mind a DNS-szekvenciáktól, mind számos körülménytől, például a sókoncentrációtól függ. A Tm fontos a PCR során, ahol a ciklus szekvenálásnak nevezett variánst alkalmazzuk a dideoxinukleotiddal végződött fragmensek előállítására. Itt a szekvenált primert kezdetben alternatív módon lágyítják, majd meghosszabbítják és végül denaturálják amplifikáció céljából. Ezért a Tm értéknek 52 o C és 74 o között kell lennieC. Szintetizált oligonukleotidok beszerezhetők a választott DNS / RNS szintézis laboratóriumokban. A DNS-szekvenáláshoz használt kis szintézisszint 50 nmol. Ami a legfontosabb, hogy a szekvenáláshoz használt primereket meg kell tisztítani, hogy ne legyenek szennyeződések, amelyek megakadályozzák a minőség csökkenését.
Milyen hasonlóságok vannak a PCR-alapozók és a szekvenáló primerek között?
- Mind a PCR-primerek, mind a szekvenáló primerek olyan primerek, amelyeket a megcélzott DNS-szekvencia amplifikációs folyamatában alkalmaznak.
- Mind a PCR-primerek, mind a szekvenáló primerek nukleotidokból állnak.
- A PCR-primerek és a szekvenáló primerek egyaránt rövid oligomerek.
Mi a különbség a PCR primerek és a szekvencia alapozók között?
Különböző cikk a táblázat előtt
PCR alapozók vs szekvencia alapozók |
|
| A PCR-primerek rövid DNS-szálak, amelyek nukleotidszekvenciája 18-25, így kompatibilisek az amplifikálni kívánt DNS-fragmensek kezdő és végrégiójával. | A szekvenáló primerek rövid oligomerek, amelyeket egy DNS-fragmens szekvenálásának összefüggésében használnak abból a célból, hogy felfedjék annak specifikus azonosságát. |
| Funkció | |
| A PCR-primereket egy adott DNS-szekvencia amplifikálásához alkalmazzuk. | A szekvenáló primereket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben alkalmazzuk azzal a céllal, hogy felfedjük annak specifikus azonosságát. |
| Szükséges alapozók száma | |
| Két alapozó; egy előreindító és egy fordított primert használunk PCR-primerekként. | Csak egy primerre van szükség szekvenáló primerként. |
Összegzés - PCR primerek vs szekvencia alapozók
A szekvenáló primereket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben alkalmazzuk azzal a céllal, hogy felfedjük annak specifikus azonosságát. Egy szekvenáló alapozó elegendő lesz a folyamat futtatásához. A jó szekvenálási eredmények elérése érdekében fontos a kiváló minőségű primerek és sablonok. Tehát, ha a primereket kiválasztjuk, azoknak egyedinek kell lenniük egy adott régióban, ahol szekvenciázni szeretnénk. A PCR-primerek rövid DNS-szálak, 18-25 nukleotidhosszal, amely kompatibilis az amplifikálni kívánt DNS-fragmensek kezdő és végrégiójával. A PCR-láncindítók lehetnek primer és reverz primerek. A jó primer guanin- és citozin (GC) tartalmának a 40-60 tartományban kell lennie. Az alapozó hőkezelési hőmérséklete és olvadási hőmérséklete létfontosságú szempont a PCR során. Ez a különbség a PCR primerek és a szekvenáló primerek között.
